De revolutie van het gebruik van fluorescerende eiwitten om onderdelen van cellen zichtbaar te maken, begon met de ontdekking hoe het inmiddels beroemde uit kwallen afkomstige Green Fluorescent Protein (GFP) in labs kan worden gebruikt. Het UvA laboratorium voor Moleculaire Cytologie, onderdeel van het Swammerdam Institute for Life Sciences, ontwikkelt en verbetert al jaren kleurstoffen en biosensoren geïnspireerd op GFP. Door de genetische code van het GFP-eiwit aan te passen kun je in plaats van groen bijvoorbeeld ook cyaan en rood fluorescerende eiwitten maken, met aanpasbare eigenschappen. Deze code of het volledige stuk DNA kan vervolgens worden gedeeld met andere laboratoria, zodat ook andere wetenschappers de fluorescerende eiwitten kunnen gebruiken voor hun onderzoek.

Calcium

Als onderdeel van haar PhD-project ging Franka van der Linden de uitdaging aan om een cyaankleurig fluorescerend eiwit te ontwikkelen dat kan worden gebruikt als biosensor om calciumniveaus in cellen zichtbaar te maken. Calciumionen spelen een sleutelrol in een groot aantal cellulaire processen. Ze zijn bijvoorbeeld nodig om spieren te laten samentrekken, ze zijn betrokken bij hersenactiviteit, en er komen calciumionen vrij als cellen hormonen waarnemen. Gezien deze universele rol van calcium in cellulaire processen is het niet verwonderlijk dat wetenschappers geïnteresseerd zijn in het meten van calciumconcentraties.

Uitdagingen

Joachim Goedhart, senior auteur van het artikel in Nature Communications, vertelt over enkele van de uitdagingen die het team tegenkwam: 'De standaardaanpak voor het meten van veranderingen in de concentratie van bijvoorbeeld calcium in cellen is om simpelweg de hoeveelheid licht dat het fluorescerende eiwit uitzendt te meten via de microscoop. Maar de hoeveelheid uitgestraald licht hangt ook af van de concentratie van de toegevoegde biosensor. Dit maakt het erg moeilijk om calciumconcentraties nauwkeurig te kwantificeren puur op basis van die hoeveelheid uitgestraald licht. Dus gingen we voor een andere benadering: wij gebruiken de zogenoemde fluorescentie levensduur als maatstaf. De levensduur van de fluorescentie is niet afhankelijk van de intensiteit van de fluorescentie, en is daarom een ideale parameter voor metingen in cellen. Het kan worden gemeten met een speciale microscoop, een Fluorescence Lifetime Imaging Microscope oftewel FLIM.'

Het kostte het team vele maanden om verschillende, steeds licht gewijzigde DNA-codes te maken en uit te proberen. Maar uiteindelijk slaagden ze erin een eiwit te maken dat een verandering in de fluorescentie levensduur geeft wanneer de calciumconcentraties veranderen. Goedhart: ‘Een heel mooi neveneffect van het cyaankleurige fluorescerende eiwit dat we gebruiken is dat het niet zuurgevoelig is. Terwijl veel op GFP gebaseerde fluorescerende eiwitten hun fluorescentie verliezen wanneer de pH daalt, geldt dat voor het cyaankleurige eiwit niet.'

Praktijktest

Van der Linden, Goedhart en hun collega's hebben het gebruik van het nieuwe fluorescerende eiwit ook al in de praktijk getest. Goedhart: ‘We hebben het gebruikt om de verhoging van de calciumconcentratie in endotheelcellen te detecteren na stimulatie met histamine. Daarnaast hebben we in samenwerking met Jaap van Buul van Sanquin Research het eiwit gebruikt om calciumconcentraties in een laag endotheelcellen te detecteren, die de binnenste laag van een bloedvat nabootsen. Een andere praktijktest hebben we uitgevoegd in samenwerking met Joep Beumer en Hans Clevers van het Hubrecht Instituut in Utrecht. In hun laboratorium werd een organoïde model van de menselijke darm ontwikkeld, een soort mini-darm. De mini-darmen werden naar Amsterdam gebracht waar we onze FLIM microscoop gebruikten om calcium te meten. Het lukte ons om de calciumdynamiek nauwkeurig te kwantificeren, wat de waarde van onze nieuwe biosensor als nauwkeurig stuk gereedschap aantoont.'

Details van de publicatie

Franka H. van der Linden et al, A turquoise fluorescence lifetime-based biosensor for quantitative imaging of intracellular calcium, in: Nature Communications, 10 November 2021, DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-021-27249-w